安捷倫1260液相系統的自動化柱前衍生功能實現伏馬毒素的高通量檢測

簡介
        伏馬毒素 (FUM) 是一種強毒性真菌毒素，普遍存在于玉米、小 麥、大米等糧食作物中，對動物和人的健康有很大的潛在危害[1]。 1993 年，伏馬毒素被世界衛生組織的癌癥研究機構劃定為 2B 類 致癌物（即人類可能致癌物）[2]。 目前發現的伏馬毒素有 FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、 FC2、FC3、FC4 和 FP1 等 11 種，其中主要組分為 FB1，已成 為繼黃曲霉毒素之后的又一研究熱點。目前，我國對伏馬毒素尚 無明確的*規定，但許多組織、已對伏馬毒素制訂了限 量標準。歐盟對伏馬毒素（FB1 和 FB2）的總量規定玉米中* 為 4 mg/kg[3]；瑞士規定人類食物中伏馬毒素*為 1 mg/kg[4]； 美國 FDA 規定以玉米為原料的食品中 FB 的大*為 2–4 mg/kg， 動物食品為 5–100 mg/kg[5]。 我國頒布的食品安全標準中，伏馬毒素的液相色譜檢測方法 包括柱后衍生和柱前衍生兩種[3]。柱后衍生方法分析時間較長， 且儀器配置除了一臺液相色譜外，還需要一套柱后衍生系統。而 柱前衍生方法步驟又非常繁瑣，需要先用移液器分別移取 100 µL 樣品和衍生試劑，再加入樣品瓶渦旋約 30 秒，并在 2 分鐘內進 樣分析，整個衍生時間需要人為控制。而且，為了保證衍生反應 時間一致，必須完成一針進樣后才能做下一個樣品前處理，整個 過程需要操作人員全程值守。 本方法在《GB5009.240-2016 食品安全標準 食品中伏馬毒 素的測定》[6] 中規定的柱前衍生方案的基礎上，運用 Agilent 1260 Infinity II 液相色譜系統的程序進樣功能，開發出一種自動化柱前 衍生的高通量快速分析方法。該方法無需額外配置設備，無需人 員值守，具有良好的重現性，而且定量限和檢測限指標* 各項主要法規的要求。

實驗部分
儀器和設備 
Agilent 1260 Infinity II 液相色譜系統，配備如下安捷倫組件： 
– Agilent 1260 Infinity II 四元泵（部件號 G7111B）
– Agilent 1260 Infinity 標準自動進樣器（部件號 G7129B） 
– Agilent 1260 Infinity 柱溫箱（部件號 G7116A） 
– Agilent 1260 Infinity 熒光檢測器（部件號 G7121B），配備標準檢 測池 (8 µL) 

標樣配制
        將伏馬毒素 FB1 和 FB2 標準混合儲備液用乙腈/水 (50%/50%) 逐級 稀釋為 2500、500、250、125、75、25 和 10 ng/mL，分別對應 于濃度級別 7、6、5、4、3、2、1。
 

表 1. 標樣配制 

自動衍生步驟 
        硼砂溶液和衍生試劑參照《食品安全標準 食品中伏馬毒素的 測定》中第三法的規定進行配制。 硼砂溶液 (0.1 mol/L)：稱取硼砂 3.8 g，用水溶解并稀釋至 100 mL，混合均勻。取該溶液 1 mL 置于 2 mL 樣品瓶中，放在 自動進樣器的 P1-A1 位置。 
        衍生試劑：準確稱取 40 mg 鄰苯二甲醛，溶于 1 mL 甲醇中，用 5 mL 硼砂溶液進行稀釋，并加入 50 μL 2-巰基乙醇，混合均勻。 取該溶液 100 μL 置于 250 μL 內插管中，然后將內插管放入 2 mL 棕色樣品瓶中，放在自動進樣器的 P1-A2 位置。剩余衍生試劑放 入 –20 °C 冰箱中冷藏，1 周內使用未發現異常。
 

表 2. 自動衍生方法設置

色譜條件 

結果與討論
        使用上述方法對伏馬毒素 FB1 和 FB2 標準樣品進行分析，第 5 級 濃度的標準樣品分析結果如圖 1 所示。結果表明，采用 Plus C18 超短色譜柱對衍生產物進行分離，能夠在 9 min 內獲得良好 的分離效果，分離時間較標準方法所需的 16 min 縮短了近 一半。
 

圖 1. 250 ng/mL 伏馬毒素標準樣品中 FB1 和 FB2 的分離結果

峰面積和保留時間重現性考察 
        對第 3 級濃度 (75 ng/mL) 的伏馬毒素標樣進行 5 次重復分析，以 考察峰面積和保留時間的重現性。結果顯示 FB1 和 FB2 的保留時 間 RSD% 均小于 0.2%，且峰面積 RSD% 均小于 1.1%，滿足 標準中兩次獨立測定結果的差值不超過算數平均值 20% 的要求， 具體結果見表 3。之所以能夠獲得良好的峰面積重現性，主要是 由于自動化柱前衍生過程中涉及的樣品和溶劑的量取均采用高精 度計量泵來實施。而且，整個衍生反應流程一致，時間恒定，從 而使得衍生效果穩定，定量結果可靠。

表 3. FB1 和 FB2 的保留時間和峰面積重現性 (n = 5)

線性范圍考察 
        依次將不同濃度的標準樣品按濃度從低到高進樣，每個濃度點進 樣三次，以濃度為橫坐標、每個濃度下 FB1 和 FB2 峰面積的平均 值為縱坐標繪制標準曲線，結果如圖 2 所示。無論是在低濃度范 圍 (10–500 ng/mL) 還是在高濃度范圍 (10–2500 ng/mL)，FB1 和 FB2 均獲得了良好的線性相關性，相關系數均大于 0.9999。
 

圖 2. FB1 和 FB2 的低濃度范圍（10–500 ng/mL，A 和 C）和高濃度范圍（10–2500 ng/mL，B 和 D）標準曲線

靈敏度考察 
        對第 1 級濃度 (10 ng/mL) 的標樣進樣分析以考察方法的靈敏度。結果如圖 3 所示。在該濃度下，FB1 的信噪比為 94，FB2 的信 噪比為 143。由此推斷，FB1 和 FB2 的檢測限可達 300 pg/mL 左右，定量限可達 1 ng/mL 左右；而標準中指出，當稱樣量為 5 g 時，FB1、FB2 的檢測限分別為 17 μg/kg、8 μg/kg，定量限分別為 50 μg/kg、25 μg/kg。因此，本方法*標準方法 要求。
 

圖 3. 10 ng/mL 伏馬毒素標樣中 FB1 和 FB2 的分離結果

結論
        本研究使用 Agilent 1260 Infinity II 液相色譜系統的程序進樣功 能，對伏馬毒素 FB1 和 FB2 進行自動衍生，可有效防止 FB1 和 FB2 衍生產物的降解。與標準方法相比，該方法可大幅提高 檢測效率，降低實驗室人工成本。并且該方法具有非常良好的靈 敏度、線性和重現性，檢測結果可靠，是一種非常適合于大批量 樣品高通量分析的方法。 


參考文獻
1. W.J. Kong, et al. Analysis of fumonisins B1 and B2 in spices and aromatic and medicinal herbs by HPLC-FLD with on-line post-column derivatization and positive confirmation by LCMS/MS. Analyst, 2012, 137: 3166-3174
2. K. C.Piancentini, et al. Mycotoxin analysis of industrial beers from Brazil: The influence of fumonisin B1 and deoxynivalenol in beer quality. Food Chem. 2017, 218: 64-69
3. SENYUVA Hamide, et al. Determination of Fumonisins B1 and B2 in Corn by LC/MS with Immunoaffinity Column Cleanup: Interlaboratory Study. JOURNAL OF AOAC INTERNATIONAL 2010, 93, 611-621 
4. Ildiko′Barna-Vetro′, et al. Development of a sensitive ELISA for the de termination of fumonisin B1 in cereals. J Agric Food Chem. 2000, 48, 2821- 2825 
5. USFDA. Draft guidance for industry: fumonisin levels in human foods and animal feeds. 2006 6. GB5009. 240-2016 食品安全標準 食品中伏馬毒素的測定
 

來源：安捷倫科技有限公司