安捷倫液相色譜實現5種食品添加劑和5種農藥殘留的分析

        食品安全涉及對禁止或*添加的食品添加劑、農藥殘留等進行分析，食品生產企業及相 關檢測機構均應建立長效的監管機制。面對大量的分析樣品，亟需建立的分析方案。 常規的逐一運行標準方法方案，在方法變更時需要手動更換色譜柱和溶劑，如需夜間 或周末更換方法，就需要安排實驗人員加班值機，否則儀器待機將處于空閑狀態；如果分 析過程中使用了含鹽等添加劑的流動相，儀器待機期間則無法進行系統的沖洗，對色譜 柱、管路和液相色譜硬件等都可能會造成危害。 
?        在 2016 年新版食品安全標準的基礎上，本文采用全自動多方法方案，對 5 種食品添 加劑[1-5] 和 5 種農藥殘留[6-10] 等 10 種分析方法進行自動序列運行。全自動多方法方案是基 于色譜柱和溶劑自動切換的液相色譜系統解決方案，基于 Agilent 1260 Infinity II 和 1290 Infinity II 液相色譜的全自動多方法方案，已用于多種類別樣品的分析[11,12]。與傳統的單臺 儀器逐一運行方案相比，全自動多方法方案自動化程度高，減少了樣品分析時間和儀器待 機時間，提高了分析效率。
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?實驗部分
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?試劑和樣品
?        甲醇、乙腈為色譜純級，購于 Merck 公司；甲酸、乙酸、乙酸銨 為分析純，購于 Sigma-Aldrich 公司；實驗用水為 Millipore Milli-Q 超純水系統制備的高純水；食品添加劑和農藥殘留標準品（見 表 1 和表 2）購于上海安譜公司。 
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?標準工作溶液配制 
?        對食品添加劑和農藥殘留標準品工作溶液，按照標準方 法[1, 2, 4-10] 或行業標準方法[3] 進行配制。 
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?儀器配置
?基于 Agilent 1260 Infinity II 液相色譜全自動多方法解決方案，典型 的儀器配置如下： 
?– 安捷倫液相色譜全自動多方法解決方案（部件號 G219A） 
?– Agilent 1260 Infinity II 四元泵（部件號 G7111B） 
?– Agilent 1260 Infinity II 多重自動進樣器（部件號 G7167A），配樣 品冷卻裝置（部件號 G7167A #100） 
?– Agilent 1260 Infinity II 柱溫箱（部件號 G7116A），內置閥驅（部 件號 G7116A#058），配 4-位置-10-端口色譜柱選擇閥（部件 號 G4237A）、毛細管組件（部件號 G4237A#005）、Agilent InfinityLab Quick-Turn 液相色譜接頭（部件號 5067-5966） 
?– Agilent 1260 Infinity II 二極管陣列檢測器（部件號 G7117C） 
?– Agilent 1290 Infinity 外置閥驅（部件號 G1170A），配 12-位置-13- 端口生物惰性溶劑選擇閥（部件號 G423） 
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?基于 Agilent 1290 Infinity II 液相色譜全自動多方法解決方案，典 型的儀器配置如下： 
?– 安捷倫液相色譜全自動多方法解決方案（部件號 G219A） 
?– Agilent 1290 Infinity II 四元泵（又稱“泵”）（部件號 G7104A） 
?– Agilent 1290 Infinity II 多重自動進樣器（部件號 G7167B），配樣 品冷卻裝置（部件號 G7167B #100） 
?– Agilent 1290 Infinity II 柱溫箱（部件號 G7116B），內置閥驅 （部件號 G7116B#058），配色譜柱識別標簽讀卡器（部件號 G7116B#072）、8-位置-18-端口色譜柱選擇閥（部件號 G4239C）、 毛細管組件（部件號 G4239C#005）、Agilent InfinityLab QuickConnect 快速連接接頭（部件號 5067-5957） 
?– Agilent 1290 Infinity II 二極管陣列檢測器（部件號 G7117B） 
?– Agilent 1290 Infinity 外置閥驅（部件號 G1170A），配 12-位置-13- 端口生物惰性溶劑選擇閥（部件號 G423）
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?軟件
?        Agilent OpenLAB CDS ChemStation C.01.07 SR3 色譜控制軟件 
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?溶劑及溶劑選擇閥的配置
?        全自動多方法方案中如果配置 1 個溶劑選擇閥，溶劑可從原來 的 4 種擴展至 15 種，如果配置 2 個溶劑選擇閥，可擴展至 25 種溶 劑。本文示例的 10 個分析方法使用了 6 種溶劑，分別為：甲醇（通 道 B）、乙腈（通道 C）、純水（通道 A 和 D1）、0.5% 的乙酸水溶 液（通道 D2）、20 mmol/L 乙酸銨水溶液（通道 D3）、20 mmol/L 乙酸銨并添加 2 mmol/L 甲酸的水溶液（通道 D4）。在儀器配置 的“通道配置”選項，選擇溶劑選擇閥的接入流路，如 Agilent 1290 Infinity II 泵，選擇 D 通道；在“溶劑”選項，編輯溶劑 信息，如溶劑名稱、pH 值、摩爾濃度等，并選擇溶劑類型；然后 在儀器分析方法的編輯過程中，針對不同的分析方法，即可方便 地選擇樣品分析及系統清洗所需要的溶劑。 
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?色譜柱及色譜柱選擇閥的配置
?        在全自動多方法方案中，針對不同的分析方法，可能會使用不 同類型或規格尺寸的色譜柱，使用色譜柱選擇閥，可自動進行 分析方法中色譜柱的選擇與切換。如 8-位置-18-端口色譜柱選 擇閥，可同時安裝 8 根短柱（柱長 < 100 mm）或 4 根長柱（柱 長 < 300 mm），或短柱與長柱的組合（一根長柱占據兩根短柱的 位置，如 6 根短柱 + 1 根長柱，或 4 根短柱 + 2 根長柱，或 2 根 短柱 + 3 根長柱）。本文示例的 10 種方法使用了 3 根色譜柱，分 別為：Agilent Poroshell EC-C18, 2.1 x 50 mm, 1.9 µm（柱 1，部件 號 699675-902），Agilent ZORBAX RRHD, SB-C18, 2.1 x 100 mm, 1.8 µm（柱 2，部件號 858700-902），Agilent ZORBAX RRHD, SB-Aq, 2.1 x 100 mm, 1.8 µm（柱 3，部件號 858700-914）。 
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?液相色譜條件
        ?5 種食品添加劑和 5 種農藥殘留分析方法中主要的儀器參數分別 如表 1 和表 2 所示，表中分別列出了自動進樣器參數、泵閥組合 參數、柱溫箱參數和 DAD 檢測參數等。
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?表 1. 食品添加劑分析的主要儀器參數?

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?表 2. 農藥殘留分析的主要儀器參數?

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?過渡方法的建立
?        全自動多方法方案的關鍵技術是實現多個方法的自動序列運行， 不同的分析方法可能會使用不同的溶劑、色譜柱和分析參數，如 流速、梯度程序、柱溫、檢測波長和進樣量等。為實現多個分析 方法的自動切換、無縫銜接，需要編輯過渡方法來進行溶劑與色 譜柱的自動選擇與切換、系統的自動平衡與清洗等。 在過渡方法中要實現溶劑置換、系統平衡、清洗和保存等功能， 可借助色譜柱選擇閥中“廢液”或“旁路”的流路設計，如圖 1 所示。在“廢液”流路中，溶劑不經過色譜柱和檢測器；在“旁 路”流路中，溶劑不經過色譜柱但流經檢測器，可根據需要選擇 適當的流路實現相應的功能。如用于不同分析方法的轉換，設置 溶劑組合比例為 50:50，可采用“廢液”的流路快速進行溶劑置 換；若用于含鹽溶劑的系統清洗，可采用“廢液”或“旁路”的 流路，并選擇純水高流速快速沖洗；對系統或色譜柱的平衡、沖 洗和保存等，可采用色譜柱的流路，選擇適當的溶劑進行沖洗， 如在樣品分析之前，使用樣品分析方法所用的起始比例的溶劑平 衡色譜柱，在樣品分析之后，使用純有機溶劑清洗和保存色譜 柱等。
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?序列的建立與運行
?        分別編輯 10 個分析方法每類樣品的序列文件，根據需要設置合適 的樣品類型，如標準曲線校正樣品、質控樣品和未知樣品等，并 采用樣品分析方法如 SAMPLE ANALYSIS.M。以方法 1 為例，在 樣品分析之前插入如 SYSTEM PRERUN.M 的過渡方法，用于溶劑 置換和系統平衡，在樣品分析之后插入如 SYSTEM POSTRUN.M 的過渡方法，用于系統清洗和保存，如表 3 所示。 
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?表 3. 序列文件中序列表的編輯?

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?        按照同樣的方法分別編輯其它類樣品分析的序列文件。在序列 隊列運行中依次添加上述多個樣品分析的序列文件，如 M1.S、 M2.S，……，并在運行隊列的后一行添加一個關機（待機）的 序列文件，如 SYSTEM SHUTDOWN.S，多方法序列運行之后， 將儀器設置為待機狀態，如自動關閉所用燈、泵和柱溫箱等。
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?結果與討論 
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?分析結果
?        按照上述方法進行儀器配置、樣品分析方法的建立、過渡方法的 建立、序列文件的建立、序列隊列的建立和運行等，所得方法 1-10 典型的色譜圖如圖 2 和圖 3 所示。

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?全自動多方法方案與逐一運行標準方法方案的比較 
?        使用小粒徑填料的色譜柱，可以提高柱效，但也會增大柱壓。 Agilent ZORBAX RRHD 粒徑 1.8 μm 填料的系列色譜柱，高耐 壓 1200 bar；Agilent Poroshell 粒徑 1.9 μm 填料的系列色譜柱， 高耐壓 1300 bar?；?Agilent 1290 Infinity II 液相色譜全自動 多方法方案，系統耐壓 1300 bar，滿足小粒徑填料色譜柱快速高 效的分析需求。以方法 9 為例，在唑螨酯的測定中，標準方 法 GB 23200.29 使用 C18, 4.6 X 250 mm, 5 μm 的色譜柱，在推 薦的色譜分離條件下，唑螨酯的保留因子 k 約為 2.16；在本文所 述的全自動多方法方案中，使用 Poroshell EC-C18, 2.1 X 50 mm, 1.9 μm 的色譜柱，唑螨酯的保留因子 k 為 5.8。與標準方法 相比，全自動多方法方案不僅保留因子增大，而且分析時間顯著 減少。?
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?        以本文示例的 10 種分析方法為例，不考慮樣品前處理等，采用單臺儀器逐一運行標準方法方案，對每個方法樣品分析前后系統準備 的時間預估為 1.5 h，如更換溶劑、平衡色譜柱、清洗色譜柱等；而采用全自動多方法方案，每個方法所使用的過渡方法時間預估為 0.5-1 h。分別采用逐一運行標準方法方案和全自動多方法方案運行食品添加劑和農藥殘留等 10 種分析方法，若每個方法進樣 40 針，兩種 方案中每個方法的總運行時間如表 4 所示。 
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?表 4. 采用逐一運行標準方法方案與全自動多方法方案分別運行 10 種分析方法的所需時間（單位：h）?

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?        在正常的周工作時間，若采用逐一運行標準方法方案，按照方法 1 至方法 10 的順序依次運行，僅考慮樣品的儀器運行時間，需要 9 天，如表 5 所示。該方案在分析方法變更時，需要手動更換色譜柱、溶劑等；有時候還需要值機，比如在第 9 天，先運行方法 8，需要 等待方法 8 運行結束，更換色譜柱之后才能運行方法 9 和 10。若采用全自動多方法方案，可自動連續序列運行上述 10 種分析方法，實現 儀器 100% 的利用率；在全自動多方法方案運行過程中，無需手動更換色譜柱和溶劑，可實現無人值守。與逐一運行標準方法方案相 比，全自動多方法方案還能減少儀器在夜間或周末的待機時間，總分析時間由 9 天減少至 2 天，分析效率大大提高。 
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?表 5. 逐一運行標準方法方案與全自動多方法方案的比較?

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        ?對不同的樣品分析方法，有些方法可能會使用含酸、堿或鹽等添 加劑的流動相，如本文示例方法 2、3、4、5、6 和 8，這幾個方 法在流動相中添加乙酸或乙酸鹽等，用于改善分離。在常規液相 色譜系統中，樣品分析之后需要手動更換溶劑，并進行色譜柱和 系統的沖洗。手動操作不僅費時費力，而且在夜間或周末就無法 進行系統的沖洗。比如，使用常規系統按照逐一運行標準方 法方案依次運行上述 10 種分析方法，在第 4 天運行方法 4，需要 15.5 h；若從上午 9 點開始，運行至凌晨結束，樣品分析結束的 時間為夜間，液相色譜系統將保存在含鹽流動相體系中，這對色 譜柱、管路和液相色譜硬件都會造成潛在的危害。 
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?        常規液相色譜一般配置 4 個溶劑通道，對四元泵，如 Agilent 1290 Infinity II 泵，配置 A、B、C、D 四路溶劑；對二元泵， 如 Agilent 1290 Infinity II 高速泵，配置 A1/A2、B1/B2 四路溶 劑。在逐一運行標準方法方案中，對使用含添加劑流動相的 分析方法，運行結束后調用通道 A 的純水，可沖洗系統中混合器 之后的管路及配件；對全自動多方法方案，調用溶劑選擇閥擴展 流路中的純水，如通道 D1 的純水，可實現系統的*清洗。以 方法 4 為例，該方法水相為含鹽溶劑（配置在通道 D4），樣品 分析之后，在過渡方法中調用溶劑選擇閥通道 D1 的純水，并采 用“廢液”或“旁路”的流路沖洗整個系統，系統沖洗完成后再 切換色譜柱選擇閥至色譜柱流路位置，先使用較高比例的純水沖 洗色譜柱中殘留的含鹽溶劑，再使用純有機溶劑對色譜柱進行清 洗和保存。與常規的液相色譜系統清洗方法相比，采用全自動多 方法方案的系統清洗方法，除了可以沖洗系統混合器后的管路及 配件，還可以對溶劑選擇閥和混合器之間的管路以及該流路脫氣 機內腔進行*清洗，如圖 4 所示，全自動多方法方案能自動進 行溶劑置換和系統清洗，實現系統的無鹽保存。?

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?全自動多方法方案的重現性 
?        以方法 1 和方法 2 連續 3 個批次的自動序列運行為例，每個樣品 重復進樣 10 次，考察全自動多方法方案批內及批間的重現性。方 法 1 和方法 2 使用*不同的流動相體系，并采用等度方法進行分 析。以方法 2 為例，通過連續 3 個批次的序列運行，對糖精鈉、 苯甲酸和山梨酸，批內及批間保留時間的精密度均小于 0.2%， 批內及批間峰面積的精密度均小于 0.3%，如圖 5 所示，說明全自 動多方法方案具有良好的分析重現性。采用全自動多方法方案進 行批次運行，對每個分析方法，批次運行前后均采用統一的系統 平衡與沖洗的方法（不同方法之間可能有差異），既提高了分析 重現性，也有利于批次間數據的比對。?
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?結論 
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?        隨著食品安全監管的加強，食品中*添加的食品添加劑和農藥 殘留的檢測任務日益增多，檢測實驗室對于提高自動化程度、提 高儀器使用效率和分析產出效率的要求也日益強烈。安捷倫液相 色譜全自動多方法解決方案在液相色譜標準模塊的基礎上，增配 溶劑選擇閥和色譜柱選擇閥，為實現多方法的全自動序列運行提 供了便利。全自動多方法方案運行期間無需手動更換溶劑和色譜 柱，能夠實現無人干預和無人值守，解放了勞動力。多個方法 自動序列運行，可充分利用夜間、周末等時間，減少儀器待機 時間，從而提高儀器使用效率。同時，使用 Agilent Poroshell 和 ZORBAX RRHD 系列小粒徑填料的色譜柱，能在滿足分離要求的 基礎上顯著減少分析時間；全自動多方法方案中使用的溶劑 置換和系統清洗的方法，可使系統得到*清洗，實現系統的無 鹽保存，在批次運行中也有利于提高批內及批間的分析重復性。 除本文示例所述的食品添加劑和農藥殘留的分析方法之外，全自 動多方法方案還可以組合其他類型樣品的分析方法，用于不同行 業和領域，如食品安全監管、藥物質量控制和環境檢測等，提高 實驗效率。?
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?參考文獻 
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?1. 食品中阿斯巴甜和阿力甜的測定；食品安全標準， GB 5009.263-2016 
?2. 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定；食品安全標準， GB 5009.28-2016 
?3. 出口食品中對羥基苯甲酸酯的測定；出入境檢驗檢疫行業標準， SN/T 4047-2014 
?4. 食品中合成色素的測定；食品安全標準， GB 5009.35-2016 
?5. 食品中 9 種抗氧化劑的測定；食品安全標準， GB 5009.32-2016 
?6. 水果和蔬菜中噻菌靈殘留量的測定；食品安全標準， GB 23200.17-2016 
?7. 水果和蔬菜中阿維菌素殘留量的測定；食品安全標準， GB 23200.19-2016 
?8. 堅果及堅果制品中抑芽丹殘留量的測定；食品安全標準， GB 23200.22-2016 
?9. 水果和蔬菜中唑螨酯殘留量的測定；食品安全標準， GB 23200.29-2016 
?10. 食品中喹氧靈殘留量的測定；食品安全標準， GB 23200.56-2016 
?11. Edgar Naegele. Agilent 1290 Infinity II 全自動多方法解決方案， 使用自動化的色譜柱和溶劑選擇閥在一臺液相色譜系統 上切換七種應用；應用簡報，安捷倫科技有限公司， 出版號 5991-5679CHCN，2015 
?12. Sonja Krieger. Different Food Applications on a Single LC System Using Automated Column and Solvent Selection Agilent 1260 Infinity II Multimethod Solution（Agilent 1260 Infinity II 全自動多方法解決方案，使用自動化的色譜柱和溶劑 選擇閥在一臺液相色譜系統上用于多種食品添加劑的分析）； 應用簡報，安捷倫科技有限公司，出版號 5991-7622EN， 2016
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?來源：安捷倫科技有限公司